自然杀伤（NK）细胞作为一种固有免疫细胞，针对衰老、病毒感染、癌变等异常细胞具有广谱免疫监视和清除功能。嵌合抗原受体（CAR）工程化的CAR-NK细胞，还获得类似CAR-T细胞的精准靶向杀伤功能，显著提升对特定抗原阳性细胞的清除效率。来自基础和临床的研究数据表明，NK/CAR-NK细胞副作用较小，但在持久疗效方面尚需优化增强。在适合用CAR-T细胞疗法的患者人群中，因为价格昂贵和制备等待时间等因素，只有低于10%的适用患者能够用上商业化的CAR-T产品。因此，开发货架式（off-the-shelf）、价廉的NK/CAR-NK细胞制剂，有望提高免疫细胞治疗的可及性和普及性，造福众多患者。当前，临床使用的CAR-NK细胞主要来自工程化的外周血或脐带血等人体组织分离扩增的成熟NK细胞，但在成熟NK阶段进行CAR工程化引入高昂成本。将CAR工程化节点前移至造血干祖细胞（CD34⁺ HSPC）阶段，结合CD34⁺ HSPC增殖和NK谱系定向诱导分化，有望大幅降低CAR工程化成本。

2025年10月7日，Nature Biomedical Engineering杂志在线发表了由中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院王金勇研究组题为Large-scale generation of iNK and CAR-iNK cells from CD34⁺ hematopoietic stem and progenitor cells for adoptive immunotherapy的研究论文（图1）。在该研究中，科研人员整合了CD34造血干祖细胞 CAR工程化、干细胞扩增和NK谱系定向诱导技术，成功建立了高效诱导脐带血造血干祖细胞（CD34⁺ HSPCs）体外产生iNK（induced NK）细胞及CD19 CAR-iNK细胞的工艺制备体系。经过42天的诱导，实现了将单个CD34⁺ HSPCs诱导输出10⁷级别的iNK细胞或10⁶级别的CD19 CAR-iNK细胞。

该方法由三个步骤组成，CD34⁺ HSPCs或转导CD19 CAR的CD34⁺ HSPCs（CD19 CAR-HSPCs）扩增（第0-14天）、通过类器官聚集体诱导获得iNK或CAR-iNK细胞（第14-28天）、以及iNK或CAR-iNK细胞的成熟和大规模扩增（第28-42天）（图2）。具体为第一步利用辐照灭活后的AFT024细胞扩增CD34⁺ HSPCs或CD19 CAR-HSPCs，经过两轮共计14天的扩增，可将1.0 × 10⁶个CD34⁺ HSPCs扩增获得1.1 × 10⁹ ± 0.2 × 10⁹个CD34⁺ HSPCs或1.0 × 10⁹ ± 0.1 × 10⁹个CD19 CAR-HSPCs，在扩增的CD34⁺ HSPCs中，CD34⁺细胞比例为71.9% ± 4.7%（数据来源于三份脐带血样品）。在CD19 CAR-HSPCs中，CD34⁺细胞比例为61.0% ± 2.4%（数据来源于三份脐带血样品）。第二步将扩增后的HSPCs或CD19 CAR-HSPCs与环境滋养细胞混合制备类器官，向NK细胞谱系定向诱导分化。本研究中，作者使用三份脐血扩增的HSPCs或CD19 CAR-HSPCs分别制备了50个类器官，每个类器官含有1.0 × 10⁴个HSPCs或CD19 CAR-HSPCs，在诱导14天后，利用HSPCs或CD19 CAR-HSPCs制备的类器官均收获了1.2 × 10⁸ ± 0.2 × 10⁸ 个CD45⁺细胞。第三步将收获的CD45⁺细胞进行NK成熟化和增殖。经过14天的诱导，HSPCs制备的50个类器官最终收获了6.4 × 10⁹ ± 0.6 × 10⁹个iNK细胞，CD45⁺CD3^-CD56⁺细胞的比例达到了99.6% ±0.0%，CD19 CAR-HSPCs制备的50个类器官最终收获了5.6 × 10⁹ ± 0.3 × 10⁹个iNK细胞，CD56的表达比例达到99.5% ±0.3%，CD19 CAR的表达比例达到62.3% ± 3.3%。CD16在iNK细胞或CD19 CAR-iNK细胞中的表达比例是37.4%-69.4%。表明本诱导方法获得的iNK细胞成熟程度高。经统计，单个CD34⁺ HSPCs诱导可获得1.4 × 10⁷ ± 0.1 × 10⁷ iNK或7.6 × 10⁶ ± 1.2 × 10⁶个CD19 CAR-iNK细胞。值得注意的是，这些iNK或CD19 CAR-iNK细胞继续培养7天后，可以进一步增殖，CD16在iNK细胞中的表达比例可达到67.8% ± 3.4%，在CD19 CAR-iNK细胞中的表达比例可达到53.5% ± 6.2%。CD19 CAR在CD19 CAR-iNK细胞中的表达依然稳定，比例为62.9% ± 5.7%。经过49天的诱导周期后，单个CD34⁺ HSPCs可获得8.3 × 10⁷ ± 0.7 × 10⁷个iNK细胞或3.2 × 10⁷ ± 0.2 × 10⁷个CD19 CAR-iNK细胞。通过本诱导工艺，理论上可将1/5份脐带血（约1.0 × 10⁶个CD34⁺ HSPCs）诱导获得1.4 × 10¹³ - 8.3 × 10¹³个iNK细胞或7.6 × 10¹² - 3.2 × 10¹³ 个CAR-iNK细胞。按照每剂次注射10⁹-10¹⁰个细胞算，可以注射760到83000剂次。更重要的是，该诱导方法大幅度节省了CD19 CAR工程化成本，CD34⁺ CAR HSPCs细胞诱导获得CD19 CAR-iNK细胞的病毒使用量是利用成熟NK细胞制备CD19 CAR-NK细胞的病毒使用量的1/140000（诱导42天）到1/600000（诱导49天）。

在体内外抗肿瘤实验中，iNK细胞的肿瘤杀伤能力与同一份脐血扩增的成熟NK细胞相似。同样，CD19 CAR-iNK细胞的特异性杀伤能力与同一份脐血成熟NK细胞制备的CD19 CAR-UCB-NK细胞也相似。CD19 CAR-iNK细胞在CDX（人源肿瘤细胞系异种移植）模型和PDX（病人来源肿瘤异种移植）模型中均展现了良好的体内抗肿瘤能力，并显著延长肿瘤负荷鼠的生存期。

综上，该研究开发了将脐带血来源的造血干祖细胞高效诱导为iNK细胞或CAR-iNK细胞的制备工艺。相比已报道的方法，该方法可以显著提高iNK细胞或CAR-iNK细胞的诱导效率，并显著降低制备CAR-NK细胞的病毒使用量。解决了CAR-NK临床转化中“数量不足、价格高昂”的核心瓶颈，为普惠化的CAR-iNK免疫治疗奠定了关键技术基础。

中国科学院动物研究所器官再生与智造全国重点实验室、北京干细胞与再生医学研究院王金勇研究员、张梦云副研究员和中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）血液与健康全国重点实验室竺晓凡教授为该论文的共同通讯作者。北京干细胞与再生医学研究院胡房晓副研究员，中国科学院广州生物医药与健康研究院李剑焕博士、王瑶博士后，中国科学院动物研究所林云轻博士生和中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）章婧嫽博士为该研究的共同第一作者。该研究在科技部国家重点研发计划（2024YFA1108302，2020YFA0112404），国家基金委自然科学基金（82450001，81925002，82300132）和国家卫健委四大慢病重大专项（No. 2023ZD0501200）等项目支持下完成。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41551-025-01522-5

图：脐带血来源iNK/CAR-iNK工程化制备技术